产品简介

ToloAccurate Mut kit 由 FastPfu DNA polymerase Premix、2 × Ezmax-Single CloneMix Plus 和特异性降解甲基化质粒的感受态细胞 JM330 组成。本试剂盒最大的特点是目标质粒 的扩增产物无需 DpnI 消化可直接快速转化高达 10⁸转化效率的大肠杆菌 JM330 感受态 细胞，同时配合以极速扩增可达 1.5 kb/s 的 FastPfu Premix 预混液，以及 10 min 超快速 无缝拼接试剂盒 2 × Ezmax-Single CloneMix Plus，最大化提高了点突变的准确率和实验 效率。如果扩增的 PCR 产物条带单一，则可直接用于重组反应，并最快可在一小时内 完成全部的点突变实验过程。快速高效的特点使得 ToloAccurate Mut kit 从众多的点突 变试剂盒中脱颖而出成为点突变构建的首选试剂盒。

产品组成

#JM330 Competent Cell 应置于-80 ℃储存，其他组分请于-20 ℃储存。

产品特点

*扩增产物不需要 Dpn I 处理，极大的节省了实验时间和实验成本。

*FastPfu DNA polymerase 超高的保真度保证了点突变的精准度，高效的长片段扩增能 力可以对 20kb 以内质粒上的任何位点进行点突变。

*FastPfu Premix 高效的扩增能力大大增加了扩增产物的产量，极大降低了甲基化质粒 的占比。

* 2 × Ezmax-Single CloneMix Plus 高效的重组能力，可对质粒上任何位点进行单点突变， 或两个不连续位点（相距不超过 50 bp）进行突变。

使用流程

常见问题与注意事项

引物设计

在待突变的位点附近设计正反向引物，正反向 引物的 5’端需包含 15-20 bp 的同源序列，若突 变位点在同源序列部分，则两条引物都需要携 带突变位点，若突变位点不在同源序列部分， 则只需一条引物携带突变位点即可，注意勿将 突变位点置于引物末端。

非目标位点突变

模板质粒扩增前携带未知突变，可重新在突变 位点附近设计引物，测序验证。 扩增循环过多，扩增过程引物突变，可降低循 环数，最好不超过 35 cycle，推荐 30 cycle。

定点突变未成功

检查引物设计是否正确。模板质粒是否为非甲基化质粒，且模板质粒是 否加入量过多。注意：模板需要使用甲基化的 质粒模板，且 1 ng 足以使 PCR 扩增正常进行。

无法扩增出条带

检查引物设计是否正确？或者体系配置有误， 需重新重复实验。模板质粒放置过久？模板的质量变差或断裂，则需重新提取质粒。

特别提醒

正反向引物的互补区 15-20 bp 应尽量避开具有 重复序列的区域，GC含量在 40%-60%为宜，低 于 30%或高于 70%均会影响点突变的效率。

Note
For research use only. Not suitable for clinical or therapeutic use.